细菌内毒素查抄法常见问题与探求
提要:
主张 总结综合细菌内毒素查抄法中的常见问题。
步骤 网络整顿工作中发现的问题，查阅国内表有关文件资料，对照分析利用情况并比力其差距。
了局与结论：从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素查抄法所涉及到的问题，以为在利用方面还必要进一步美满、规范。
[关键词：细菌内毒素查抄法；问题]
Discussion of common issues in the Bactaril Endutoxin Test, BET
ZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination, Wuhan 430064）
ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTS and CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.
Key word: Bactaril Endutoxin Test； problems
细菌内毒素查抄法(Bactaril Endutoxin Test,BET )是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中央品中内毒素传染的一种步骤；作为家兔热原查抄法的一种代替，已经极度成熟，美国药典迄今已为八百余种药品造订了该项查抄法，中国药典自1990年版起头收载以来，每版药典细菌内毒素查抄种类也逐步增多，2005年版已增长到204种，并且在补充本中将持续增长收载数量，该步骤相对家兔热原查抄法而言，有劳动强度低、快捷、经济、活络和易于尺度化蹬着点，受到宽大药品质检人员高度关注。2005年版药典在2000年版药典基础上在步骤学、结构及细节上均进行了沉大订正，使其越发规范、合理。
由于该步骤自身是一复杂的酶促反映过程，试验步骤比力多，每个种类的限值造订和试验过程中涉及到的尺度品、j9游戏、查抄用水及滋扰成分等，均会给对尝试了局造成分歧水平的影响，以下是笔者近年来在药品检验过程中发现的较为常见的问题进行的汇总, 以期对现实工作拥有参考价值。
1、尺度及限值的造订
一个种类的尺度及限值造订的安妥与否，直接决定了对药品自身质量的评价要求，尺度要求太高、限值过严，往往影响产品的合格率，太松则不能保障药品质量，危及临床用药安全。为此，列国药典均提出了根基的造订准则，除特殊情况必要注明表，通常注射剂均按人最大体热阈值和人临床每幼时每公斤体沉最大使用剂量的关下反确定，即L=K/M（通常静脉给药的K值为5Eu/kg，M为人每幼时每公斤体沉最大使用剂量），而大输液(100-500ml) 的限值列国根基是一致的，无论是复方还是单方面，均可按单元体积中所含内毒素的量来节造，（通常按 0.5Eu/ml）；看似单一的问题，在执行中却时时出现各类各样的问题。常见问题举例如下：
1．1 应以沉量(mg)暗示的错用体积(ml)暗示
注射用更昔洛韦钠，按公式推算，其限值应为1.0 Eu/mg，但出产单元要求改为0.5Eu/ml，且未提供任何造订理由，也未注明稀释步骤。使检验人员无法操作。
1．2 不按人临床用量推算，按热原剂量推算
精氨酸阿斯匹林，若按人临床用量推算其限值应为0.3Eu/mg，但查抄法造订中却按热原剂量推算为0.03Eu/mg，严格了10倍，因浓度较高，出现了滋扰，给试验带来了麻烦。
1．3 轻易放宽尺度
有的新药研发单元对自己的产品没有信心，或按划定的限值不能过关（检验不合格或有滋扰），则将尺度轻易放宽，如0.5Eu/ml，研发单元自行改为“稀释6倍后，按0.5Eu/ml。。。。。。”，放宽了6倍，且未注明理由。
1．4 照搬谬误的尺度
一种类限值凭据其临床用量推算应为5Eu/mg，但已有暂行国度尺度，限值为75Eu/mg，厂家则要求改为75Eu/mg，现实上第一个厂家所报尺度没有凭据，但由于漏审或未经专业人员审查直接造成了国度尺度，此类尺度太松。无法节造质量。
1．5 一样种类拥有分歧的国度尺度
在2004年全国大输液抽样检验的500批样品中，细菌内毒素查抄和热原查抄尺度较为混乱，有的选取家兔热原查抄法，有的则是细菌内毒素查抄法，且部门内毒素查抄法统一种类限值却不一样。例如：克林霉素磷酸酯注射液，有的尺度限值划定为0.5 Eu/mg，有的则为0.6 Eu/mg 。
1．6 轻易批改，将正确的改为不正确
某一注射用药品，某省地点进行步骤学钻研时，按临床用量推算后将限值定为60Eu /mg；申报单元在资料汇总时改为：“取本品，加水5ml，再稀释8倍，每瓶含内毒素的量不得过100 Eu”。（本品规格为：10mg/支，人用量5mg/次）。只管批改后的尺度较之批改前严格了，但对尺度的批改没有提供任何支持的尝试数据。此表，该尺度尚存在三处显著的谬误，其一是没有注明细菌内毒素查抄用水，而是仅仅描述为加水。其二是没有划定具体的药品规格，只是描述为“每瓶含”，忽视了每瓶可能带来的规格问题。其三则是限度的划定尽可能不使用类似“不得过”的描述，目前更正确的描述多选取“应幼于.....”
1．7 检验步骤表述不明显
紫杉醇注射液：“取本品，加细菌内毒素查抄用水至少稀释40倍后，依法查抄（附录2000年版 ⅪE），每ml中含内毒素的量应幼于2.4Eu”；此类表述很容易引起理解上的谬误，是原液中的限值为2.4Eu /ml，还是稀释后每ml中应幼于2.4Eu ？无经验的操作人员往往会以为是后者。此类问题，2002年全国药理室主任会及05年版内毒素种类扩大会议已有统肯定见，不提倡如此写法，因分歧厂家、分歧工艺出产的统一种类样品往往滋扰水平不一致，稀释倍数就不愿定一样（出格是中草药注射剂）。
1．8 在药典尺度中出现原料药与造剂限值不一致
阿米卡星（造剂）0.33Eu/mg，原料2.2Eu/mg，前者是推算值，后者若何得来，不得而知。（已将后者勘误纠正为0.33 Eu/mg）
1．9 用灭菌注射用水包办细菌内毒素查抄用水
某质量尺度记述为：“取本品，加灭菌注射用水10ml溶化后，依法查抄．．．．．．”。此类尺度往往是按说明书上临床用法照搬而来的。
2、查抄步骤及滋扰试验
2．1样品查抄
在对样品进行查抄时，由于研发单元对检验人员的专业技术培训不够，使得操作者对尺度及操作中的根基概想分辨不清，理解有误。例如：
2．1．1 0.5ml/支装量与活络度0.5Eu /ml的j9游戏， 0.5Eu/ml与0.5EU/mg限值的概想不清。
2．1. 2 配造样品溶液时，在理解限值（L）与j9游戏活络度 ( λ ) 的关系问题上概想吞吐，如：青霉素限值为0.01Eu/100u；有的用户就以为肯定要0.01Eu/ml活络度的j9游戏；又如甲硝唑注射液，从前的尺度限值0.35Eu/ml，就要求买0.35Eu/ml活络度的j9游戏。
2．1. 3 不论种类性质是否适合将家兔热原查抄法改为内毒素查抄法，从而导致了尺度上的不统一和了局的不一致。如：中草药注射剂，一些新生物制品，某些医疗器材等，它们造成的发热可能不仅仅是内毒素，可能还有多糖核苷酸，高分子抗原或半抗原等非内毒素热原，细菌内毒素查抄不能检测出该类物质，一味地将这类产品改为BET，在临床上可能就存在热原反映的隐患
2．2 滋扰试验
在对某一种类成立细菌内毒素查抄法的过程中，滋扰尝试是极度沉要的环节，只有证实该种类不存在滋扰或去除了滋扰，能力用于日常的检验。滋扰的类型重要阐发为抑造滋扰和加强滋扰。好多尝试室的经验批注绝大部门的滋扰成分来自于样品，如：分歧起源的原料、出产工艺的扭转，导致样品的PH、样品的成分、样品的浓度等变动。因而，即便来自分歧厂家的统一种类，其出产质量也不尽一样，所以应该要求每个出产厂家在报批时均应提供有关步骤学的钻研汇报。
表此刻步骤学验证及样品最大无滋扰浓度上的问题重要有：
2．2. 1 以为国内或国表已有出产的种类，步骤学验证就能够不做。造成大量的新药尺度－出格是仿造药未做系统的滋扰试验。
2．2 . 2 以为肯定要按最大有效稀释倍数（Maximum valid dilution MVD）或最幼有效浓度（Minimum valid concentration MVC）进行尝试。现实上，有的样品浓度很高也不滋扰j9游戏与内毒素的反映，这种情况下，只有样品内毒素含量合格，能够在MVD领域之内，即幼于MVD的倍数下进行试验，若是一个样品在幼于MVD的情况下试验时样品阳性管有滋扰，或样品管为阳性，可再按MVD进行相对应的稀释沉新试验.
3、与国表尺度的差距
3．1.单次试验j9游戏的加样
j9游戏的规格分单次试验瓶（STV）及屡次试验瓶(MTV)两类。目前世界上除中国表其它国度STV的使用都是直接加0.2ml样品溶液复溶试剂兼查抄。中国药典对STV要求是先加0.1ml BET水复溶，再加0.1样品溶液作查抄。
3．2.工作尺度品的效价标定
内毒素工作尺度品(CSE)的效价标定有两种步骤，一种是浮动效价标示法，另一种是固定效价标示法。浮动效价标示法对每批号CSE只标示它的含量（沉量，如mg, ng等），倒剽批号CSE确定配那一批j9游戏使用时，j9游戏厂家才向用户提供一份效价测定证书(Certificate of Analysis, CoA)，给出使用该批号j9游戏测定的RSE/CSE比率以及该批号CSE的效价。固定效价标示法是以某一批（或数批）j9游戏测定该批CSE的RSE/CSE比率，从而推算出该批CSE的效价。例如，某批j9游戏对某批CSE的RSE／CSE比率是8Eu/ng，该批CSE的装量是10 ng/支，则CSE的效价就是8Eu/ng×10ng/支＝80Eu/支，以此作为该批CSE的标示效价。目前欧美国度选取的是浮动效价标示法，我国选取的是固定效价标示法。以上两种效价标示步骤都有所长和不及，其利用布景也不尽一样。
严格寺反，中国的工作尺度品和美国的工作尺度品在界说上不齐全一致，中国药典对内毒素工作尺度品的界说是：系以细菌内毒素国度尺度品为基准标定其效价，用于尝试中j9游戏活络度复核、滋扰尝试和设置的各类阳性对照。美国内毒素工作尺度品最初的使用是源于国度尺度品的用度较高和对国度尺度品的潜在亏损，成立工文章的重要主张是作为国度尺度品的代替品，用于日常内毒素检测工作的，由于美国尝试j9游戏批批检造度，因而工文章不用于j9游戏活络度的复核，重要是用于设置各类阳性对照（阳性对照和供试品阳性对照）和确证试剂、尝试资料和操作步骤的可行性；FDA对工文章不进行节造，由出产厂家自行出产和治理。
在我国，现阶段对j9游戏的活络度没有进行批批检定，j9游戏的出厂检验一向是由厂家自行按部颁尺度进行；由于各j9游戏厂家之间的出产前提、工艺技术水平还存在肯定差距，很难保障每一批j9游戏的活络度都切合尺度，为此划定用户在使用前用统一的工文章复核活络度；应该说，中国的工作尺度品除了佑装工作”的寓意表，还有肯定意思上的“监控”作用�；诖�，就现阶段来说，我们还无法评价国内表这种标定差距上的利与弊，进展今后能在不休的实际过程中，能找出更为有效的、合理的法子。
3.3 对供试品溶液pH要求
中国药典BET法对供试品溶液的pH值要求在6.0~8.0的领域内。但现实上，有很多样品溶液的pH值不在此领域内也对BET不造成滋扰，原因是j9游戏自身有缓冲能力。事实上，应该这样以为：一个供试品是否要调节pH值，应凭据滋扰试验的了局来判断。若是该供试品对BET有滋扰，且滋扰的原因是由pH值不合适造成的，才有必要调节供试品的pH值。美国药典BET法对供试品溶液pH的要求是：测定供试品溶液与j9游戏溶液的等体积混合液的pH值，应在6.0~8.0领域内。这意味着当供试品溶液的pH值的影响超出了j9游戏的缓冲能力时，才必要去调节供试品的pH。
4、关于细菌内毒素查抄用水
2005版药典划定凝胶法用细菌内毒素查抄用水内毒素的量应幼于0.015Eu/ml ，对使用活络度为0.5Eu/ml的j9游戏没有多大问题，但若是用0.03Eu/ml的j9游戏则可能存在问题。若是试验了局为阳性，则应慎沉思考。
5 、其它
5、1不宜成立BET的种类
凭据本尝试室经验 ：
5.1.1中草药注射剂，由于中药成份复杂、滋扰成分多、统一种类样品往往滋扰水平不一致，且阳性率偏高；如炎琥宁，复方丹参注射液、红花注射液、紫杉醇注射液等。
5.1.2部门生物造剂及钙镁离子鳌合剂，酶抑造剂等
5.2必要处置的种类
5.2.1 不合适的pH前提，如样品的 pH值偏高或偏低，可用碱性或酸性缓冲液来调节至相宜的pH值领域，或选取高活络度j9游戏进行相应稀释后来解决。浓度较高的氨基酸种类及部门抗生素种类均可通过通过以上步骤来解决滋扰。
5.2.2 由于j9游戏中促使凝胶形成的丝氨酸蛋白酶能够被多种化学物质变性失活（如醇、酚、抗癌药物等），若是导致j9游戏变动的药物是蛋白酶类，可用70℃加热10分钟左右热处置后再稀释，或者使用超过滤的步骤。
5.2.3 对钙镁离子有鳌合作用的种类，可使用含钙镁离子的溶液来稀释样品。
以上方式均需进行步骤验证，以证明对增长内毒素回收不存在抑造或加强，能够通过与水中对照内毒素的回收进行比力得以验证。
5.3 成立BET 该把稳的事项
5.3. 1 大输液种类限值通常定为0.5Eu/ml., 幼剂量注射剂及冻干剂限值按人临床用每幼时每公斤体沉最大给药剂量推算，同时应试虑结合用药及给药蹊径，推注、静注应从严把握，必要时，对L值应作相应调整。单纯的肌肉给药且用量不大的种类能够不成立BET。
5.3.2 限值单元表述步骤应正确、规范；注射用、冻干剂通常以主药含量推算，以Eu/mg暗示；不宜用Eu/每瓶暗示。幼剂量注射液用Eu/mg或Eu/ml均可；大剂量注射液通常用Eu/ml暗示。
5.3. 3 所有稀释用水均应为细菌内毒素查抄用水，由于注射用水和其它去离子水中内毒素及其它成分节造要求较低，会影响细菌内毒素的查抄。
5.3.4尺度的造订应有凭据，应有草拟注明. 不仅仅新药，仿造药也应做步骤学钻研；由于分歧的工艺出产的样品往往质量不一样；建议使用三批分歧功夫出产的样品，用2个以上厂家出产的j9游戏进行步骤学钻延注以调查造剂工艺的不变性。