本文起源：中国中药杂志， 2017年17期 ：补体抑造活性物质鱼腥草总多糖中内毒素的去除，如需删除请注意，感激。
[关键词]
鱼腥草总多糖、内毒素、显色法基质j9游戏河注乐山j9游戏、 抗补体、 疏水色谱、亲和吸附色谱
[布景]
魚腥草Houttuynia Herba为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草和干燥的地上部门，拥有利尿通淋、抗炎抗过敏、加强机体免疫力等功效[13]。补体系统（complement system）是将对病原体的鉴别有效地转化为宿主对最初习染阐扬防御职能的重要机造之一。补体的过度激活会引起人体免疫系统的过度反映，参加多种疾病的病理过程[4]，临床上目前尚无梦想的医治药物。近年来，本课题组致力于中药补体抑造剂的钻研，分离得到了一些高效、低毒的幼分子化合物及大分子多糖类天然补体抑造剂[58]。其中，鱼腥草总多糖抗补体活性较强[9]，同时拥有显著的解热和防治内毒素（lipopolysaccharides，LPS）诱导的急性肺危险药效[1011]，临床开发利用远景优良。
[提要]
本尝试通过柱色谱联用去除鱼腥草总多糖中的LPS，以显色基质比色法定量检测内毒素含量，比力疏水色谱与亲和吸附色谱的联用及凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用对LPS的断根率，同时比力LPS断根前后鱼腥草总多糖体表补体抑造活性的变动，为中药活性多糖药物中LPS的去除提供步骤参考。
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1 资料
鱼腥草，经鉴定为三白草科Saururaceae 蕺菜属植物蕺菜H. cordata的干燥地上部门。鱼腥草总多糖为选取课题组前期优化工艺自造[9]。endprint
LPS对照品（Pharmacia Biotech）；显色基质法j9游戏盒；透析袋。氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸及苯酚均为国产AR级，苯酚用前沉熏。
j9游戏显色基质j9游戏盒
电子天平，TDL4型低速台式离心理，Well scan MK3型酶标仪，EYELAOSB2100型旋转蒸发仪，精达水浴恒温振荡器，RLPHR 12 LD型冷冻干燥器，UV759S 紫表可见分光光度计，HL2S型横流泵，BSZ100型自动部门网络仪。
2 步骤
2.1 显色基质法[21]定量检测LPS含量
2.1.1 反映试剂的配造 按标示量加细菌内毒素查抄用水溶化j9游戏，j9游戏应于溶化后10 min内使用。按标示量加内毒素查抄用水溶化显色基质。按标示量加反映终止剂HCl配造偶氮化试剂1。按标示量加内毒素查抄用水溶化偶氮化试剂2，3。
2.1.2 对照品及待测样品溶液的配造 精密称取适量对照品，用细菌内毒素查抄用水配造成浓度别离为0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU·mL-1或0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU·mL-1。精密称取适量待测样品，加内毒素查抄用水配造成待测样品溶液。
2.1.3 阴性对照品溶液的配造 取100 μL内毒素尺度溶液及100 μL待测样品溶液，参与100 μL细菌内毒素查抄用水，混匀，即为阴性对照品溶液。
2.1.4 内毒素含量测定步骤 取300 μL对照品，参与j9游戏100 μL，混匀，凭据其内毒素浓度领域别离于37 ℃温浴45 min或8 min后，参与显色基质溶液100 μL，混匀，37 ℃温浴6 min，持续参与偶氮化试剂1、偶氮化试剂2和偶氮化试剂3溶液各500 μL，混匀静置5 min，于545 nm下测定其吸光度。
以吸光度值为纵坐标，内毒素浓度为横坐标，成立尺度曲线，求回归方程。
阴性对照品溶液或待测样品溶液的内毒素浓度丈量法同上。
2.1.5 供试品滋扰尝试 由于要调查试验中各成分对j9游戏、尺度品或待测样品反映的影响，故需进行供试品滋扰尝试，推算回收率�；厥章释扑惴绞饺缦拢�
R=（Cs-Ct）/Cr×100%
Cr：拔取靠近内毒素尺度曲线中点的浓度；Cs：配造含有内毒素浓度为Cr的供试品溶液，其丈量所得的内毒素浓度值记为Cs；Ct：未增长内毒素的供试品所测得的内毒素浓度值。
当R在50%～200%时，以为此尝试前提下对供试品溶液不存在滋扰。若R超出此领域则需进一步对供试品进行稀释，沉复供试品滋扰尝试至R进入50%～200%。通常选择R靠近100%时的供试品浓度进行供试品的内毒素含量测定。
3 了局
3.1 内毒素尺度品回归方程的成立
当LPS浓度领域为0.01～0.1 EU·mL-1时，回归方程为Y=0.872 9X-0.040 9，R2=0.992 8；LPS浓度领域为0.1～1.0 EU·mL-1时，回归方程为Y=6.183 1X-0.002 5，R2=0.995 3。
3.2 鱼腥草总多糖中内毒素的去除
3.2.1 凝胶过滤色谱法与亲和吸附色谱法联用 将鱼腥草总多糖经Sephacryl S300柱洗脱后的洗脱液6～10管归并、透析、冻干，记为H1；将H1样品再次经AffiPrep Polymyxin柱纯化，其洗脱液的3～5管归并、透析、冻干，记为H1′， 见图1。
3.2.2 疏水色谱法与亲和吸附色谱法联用 将鱼腥草总多糖经Penyl Sepharose 6 FF柱洗脱后的洗脱液6～13管归并、透析、冻干，记为H2；将H2样品经AffiPrep Polymyxin柱洗脱后的3～5管归并、透析、冻干，记为H2′，见图2。
3.3 供试品滋扰尝试
为预防试验中各成分对j9游戏、尺度品或待测样品反映的影响，对供试品进行了滋扰尝试，推算回收率，并选择回收率靠近100%时的供试品浓度进行供试品的内毒素含量测定。鱼腥草总多糖的质量浓度达到0.000 79 g·L-1时，回收率为靠近100%；H1的质量浓度达到0.000 78 g·L-1时，回收率为靠近100%；H1′的质量浓度达到0.001 25 g·L-1时，回收率为靠近100%；H2的质量浓度达到0.000 85 g·L-1时，回收率为靠近100%；H2′的质量浓度达到0.001 g·L-1时，回收率为靠近100%，见表1。
3.4 内毒素的含量测定与抗补体活性测定
取鱼腥草总多糖及3.2项分歧水平纯化样品H1， H1′， H2， H2′，凭据滋扰尝试了局，别离配置回收率靠近100%的各样品溶液，以2.4项所述步骤测定其内毒素含量；取上述各样品按2.5项步骤测定抗补体活性CH50。鱼腥草总多糖分歧步骤纯化前后的内毒素含量及抗补体活性变动了局见表2。
LPS去除率=（总多糖LPS量-纯化片段LPS量）/总多糖LPS量×100%